近期，Nano Letters 报道了香港理工大学赖溥祥教授团队、华南师范大学詹求强教授团队、中国科研院深圳先进技术研究院郑炜研究员团队和中国科研院自动化所惠辉研究员团队联合取得的新成果，相关工作“Deep-Penetrating and High-Resolution Continuous-Wave Nonlinear Microscopy Based on Homologous Dual-Emission Upconversion Adaptive Optics”（ Nano Letters 25, 5485-5492 (2025). http://doi.org/10.1021/acs.nanolett.5c01030 ）展示了一种基于同源双发射上转换自适应光学的深穿透高分辨率陆续在波非线性显微镜。该方法利用 Tm3+ /Yb3+ 共掺杂 UCNP 的 455 nm/800 nm 双发射：800 nm 发射用于深层组织中的像差测量（导星），455 nm 发射用于相应深度的高分辨率成像。瓦力棋牌瓦力利用自制的 975 nm 陆续在激光器的非线性激光扫描显微镜，在存在显著光学像差的小鼠脑组织环境中，实现了 500 μm 深度近衍射极限的成像（横向 480 nm）。该策略拓展了上转换纳米颗粒（UCNP）的应用，并对深层组织光学特性的探索给予了新的思路。

该工作利用瓦力棋牌瓦力光学JCOPTIX给予的BS分束镜产品实现了同时的近红外波前探测和高分辨成像。

非线性光学显微镜 (NLOM)，以多光子显微镜 (MPM) 为例，利用非线性光与物质相互作用产生荧光进行成像。在过去的 20 年中，NLOM 已被广泛应用于揭示细胞结构、生物分子分布以及生命过程的动力学。在这些应用中，成像分辨率通常随着非线性阶数的增加而提高，然而，由于传统的非线性荧光团由于其吸收截面较小而表现出低阶非线性，因此实际应用中的非线性度受到限制。因此，高强度超快飞秒激光脉冲对于产生足够的非线性信号至关重要。此外，使用这些非线性荧光团时，诸如光漂白、光毒性和再激发背景等问题也不容忽视。

上转换纳米粒子 (UCNP) 通常掺杂镱敏化离子 (Yb3+)，最近被用作 NLOM 中的新型探针。与传统非线性荧光团相比，UCNP 的能级寿命更长，从而能够进行陆续在光子吸收过程，将高能近红外激发转换为多个反斯托克斯发射。这绕过了前面提到的非线性激发要求，从而可以使用更具成本效益且易于取得的陆续在波 (CW) 近红外激光器代替高强度飞秒激光器。此外，UCNP 固有表现出高阶非线性，比传统非线性荧光团具有更高的分辨率和更好的信噪比。

尽管 UCNP 具有这些优点并且可以使用 NIR 激光激发来减轻散射，但深层组织中仍然存在像差，类似于传统 MPM 中遇到的像差。在深层组织成像中，光学像差和散射会破坏衍射极限焦点的形成，从而降低信号完整性、对比度和分辨率。传统上，已经开发出一种直接波前传感自适应光学 (AO) 方法，顺利获得校正散射介质中沿激发路径的像差来恢复到衍射极限焦点。该方法采用 Shack-Hartman 波前传感器 (SH-WS) 顺利获得在样本内部创建荧光导星 (GS) 来测量波前畸变。SH-WS 元件上的 GS 图像的清晰度对于有效校正像差至关重要。然而，在哺乳动物大脑等组织中，强烈的散射会衰减形成 GS 的弹道荧光，并产生弥散的背景，从而遮挡弹道信号，使像差测量变得复杂。光学散射与波长相关，波长越短，散射越多。因此，虽然 UCNP 的可见光（VIS）GS 由于其高阶非线性特性而给予了更好的成像质量，但由于其易受散射的影响，它并非深层组织像差测量的最佳选择。

本研究利用 Tm3+ 和 Yb3+ 共掺杂上转换纳米颗粒（UCNP）在 975 nm 陆续在波激发下的同源双发射特性，提出了一种基于同源双发射上转换自适应光学系统（HDU-AO）的深穿透高分辨率陆续在波非线性显微镜。UCNP 的近红外（800 nm）发射由于散射小且波前与激发光畸变谱更接近，可作为靶标；可见光（455 nm）发射由于其四光子上转换效应，可用于高分辨率成像。顺利获得比较发现，455 nm 发射具有更高的分辨率和信噪比，而 800 nm 发射则能够更深入地穿透小鼠脑环境。随后，瓦力棋牌瓦力证明了所提出的方法在体外成像中的适用性，顺利获得将瓦力棋牌瓦力的方法集成到自制的非线性激光扫描显微镜中，瓦力棋牌瓦力可以在复杂的 500 μm 厚的小鼠大脑环境中清晰地分辨出横向分辨率为 480 nm 的纳米颗粒。

HDU-AO 的详细流程如图 1所示。UCNPs 同时掺杂了 Tm3+ 和 Yb3+ ，在 975 nm CW 激光激发下可发射两种不同的上转换波长：455 nm 的 VIS 光和 800 nm 的 NIR 光。如图 1a 所示，与 NIR 光相比，VIS 光发射表现出更高的非线性效应，从而产生了更清晰的点扩展函数 (PSF)，因此适合用于成像。相反，NIR 光发射可用作像差校正的 GS，因为与 VIS 光发射相比，NIR 光散射更少，并且与激发光的畸变轮廓的对准程度更高。这样，SH-WS 可以捕获由光斑矩阵组成的更清晰、更明亮的图像（ 图 1b）。顺利获得利用 800 nm 发射作为深层组织中校正的 GS，瓦力棋牌瓦力可以使用 455 nm 发射实现高分辨率 AO 成像，即使在具有挑战性的深度下也是如此（图 1c）。

1）光控可见光和近红外辐射的成像对比分析

如图 2 所示，对 VIS 和 NIR 发射的成像质量和穿透能力进行了比较分析。 图 2a 显示了使用 VIS 和 NIR 发射的 UCNP（无散射盖）的扫描显微图像。 如图 2a 所示，与 455 nm 发射的结果相比，800 nm 发射的结果表现出明显的背景噪声。这主要是因为 800 nm 发射与双光子激发过程有关（Slope800 = 1.69），这会导致相当大的失焦荧光背景。此外， 图 2a （iii）和（iv）中所示的两个 UC 珠的分辨率显着提高，分辨率分别从 990 和 850 nm 提高到 610 和 590 nm。这些结果表明，VIS 发射给予了更高的 SNR 和更高的分辨能力（ 图 2a ），这表明 VIS 发射更适合高分辨率成像。为了评估穿透能力，UCNP 样本上覆盖有来自 BALB/c 小鼠的各种小鼠脑切片（ 图 2b ），厚度范围从 100 到 600 μm，增量为 100 μm。随着脑切片厚度的增加， 图 2c 和 2d 分别显示了 SH-WS 使用 VIS 和 NIR 发射捕获的图像。结果表明，VIS 发射的点图变得模糊且难以区分，特别是在厚度超过 300 μm 时，而 NIR 发射的点图在整个实验过程中仍然清晰可辨。 这表明近红外光发射更适合用作光谱仪。由于可见光和近红外光发射同源，HDU-AO 给予了一种稳健而直接的策略，可在陆续在波激发下实现深层组织的高分辨率成像。

第一时间利用所提出的方法研究了折射失配引起的像差。将长方体和倾斜的聚二甲基硅氧烷 (PDMS) 片（折射率：1.41）分别放置在物镜和样品之间，导致明显的折射失配（ 图 3a 和 3g ）。分析了 SH-WS 捕获的每种 PDMS 类型的点图（ 图 3e 和 3k ），然后使用点移图和泽尼克多项式重建像差（ 图 3f 和 3l ）。计算结果表明，长方体 PDMS 配置主要引起球面像差（ 图 3f ），而倾斜配置会引入明显的彗差和像散（ 图 3l ）。瓦力棋牌瓦力在此处以 ∼25 kW/ cm2 的激发功率密度采集图像。校正后，可以观察到纳米颗粒图像的锐度和清晰度显著增强（ 图 3b 和 3h ）。值得注意的是，由于不对称像差导致急剧变形的纳米颗粒在校正后恢复了正常的圆形（ 图 3h ）。为了更具体地证明其有效性，从全视场中提取了来自三个不同视角的单珠图像（ 图 3c 和 3i ）。如图所示，校正后，不需要的鬼影信号被有效消除，横向和轴向分辨率以及峰值信号强度均得到显著提高， 如图 3d 和 3j 所示，分别显示了每种 PDMS 类型的横向 (i) 和轴向 (ii) 强度分布。

为了评估瓦力棋牌瓦力的 HDU-AO 方法在深层组织环境中的性能，瓦力棋牌瓦力对从 BALB/c 小鼠中取得的 500 μm 厚的固定鼠脑切片覆盖的样本进行了成像（ 图 4a ）。如果不进行校正，激发波前会被脑切片严重扭曲，使得信号与背景噪声无法区分（ 图 4b ）。如图所示，像差校正显著提高了可见度和分辨率，这顺利获得图 4b 中彩色编码的侧面图像的比较可以证明。光斑移动图和像差图案显示，500 μm 脑切片的散射主要导致球面像差（ 图 4c (i) 和 c(ii)）。在这里，瓦力棋牌瓦力在 500 μm 小鼠脑切片之前以 ∼60 mW 的激发功率采集了图像。为了定量验证像差校正能力，瓦力棋牌瓦力选择了两个不同深度（522 和 530 μm）的图像（ 图 4d -g）。值得注意的是，522 和 530 μm 深度处的四个子区域的放大图像显示信号和分辨率均明显增强（ 图 4d-g）。组织散射导致物镜焦平面焦点扭曲，严重降低了 VIS 信号的激发效果，导致一些大纳米颗粒的形态弥散（ 图 4d(ii) 和 f(ii)）并且无法激发大多数纳米颗粒（ 图 4d(iii) 和 f(iii)）。校正后，VIS 信号可以被准确激发，给予高分辨率和高信噪比，峰值强度增强 5 倍以上（ 图 4h）。 此外， 图 4d–g(iv) 所示的傅里叶光谱表明，经过 HDU-AO 校正后，更多高频成分变得清晰可见。尤其值得一提的是， 图 4h(ii) 和 4h(iv) 中的傅里叶光谱和强度分布均表明分辨率达到约 480 nm，类似于在没有强散射的情况下的衍射极限成像。这些结果表明，在以近红外光作为自适应光学的导星进行像差校正后，HDU-AO 可以实现深层组织中可见光发射的高分辨率成像。

本研究介绍了一种基于同源双发射上转换自适应光学器件的陆续在波非线性成像显微镜，这是一种利用 Tm3+ 和 Yb3+ 共掺杂的上转换自适应光学纳米颗粒（UCNP）实现深层组织高分辨率成像的创新方法，该纳米颗粒在 975 nm 陆续在波激发下能够同时发射 455 nm 和 800 nm 波长。UCNP 的这种双发射特性为测量和校正像差以实现深层组织高分辨率成像给予了新的视角。顺利获得利用 UCNP 的同源双发射特性及其他优势，这种创新配置有效地克服了传统声光在深层组织中的局限性，在脑切片至少 500 μm 的深度范围内实现了约 500 nm 的分辨率，同时将背景信号降至最低。

香港理工大学生物医学工程系2021级博士生姚靖为本文第一作者，赖溥祥教授、詹求强教授、郑炜研究员和惠辉研究员为本文共同通讯作者。香港理工大学余志鹏博士、中科院深圳研究技术研究院博士生高玉峰、华南师范大学王保举博士给予了重要建议与指导。本工作在国家自然科研基金和the Hong Kong Research Grant Council等项目的支持资助下完成。

作者特别感谢南京瓦力棋牌瓦力光学科技有限公司（JCOPTIX）给予的光学元件与仪器支持。